支原體是一類能自我復(fù)制的最小的原核生物，可透過一般過濾膜且對(duì)抗生素具有一定耐藥性，是原代細(xì)胞跟傳代細(xì)胞的常見污染物，其會(huì)改變細(xì)胞的 DNA、RNA 及蛋白表達(dá)。
支原體污染嚴(yán)重危害科研學(xué)者們的勞動(dòng)成果，早發(fā)現(xiàn)早處理，把損失降到最低。《藥典三部 2015 版》-3301 支原體檢驗(yàn)-要求應(yīng)同時(shí)進(jìn)行培養(yǎng)法和指示細(xì)胞培養(yǎng)法（DNA 染色法），也可采用國(guó)家檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)認(rèn)可得其他辦法。這里筆者來簡(jiǎn)單介紹一下目前實(shí)驗(yàn)室常見的支原體檢測(cè)方法：

1.培養(yǎng)法

培養(yǎng)法是通過將待檢測(cè)樣品先接種到支原體液體培養(yǎng)基中大量繁殖，然后再轉(zhuǎn)接種到支原體固體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一段時(shí)間后（大約一個(gè)月），如果固體培養(yǎng)中出現(xiàn)典型的支原體菌落，則說明待測(cè)樣品有支原體污染。
 

 

2、RD-RCA 恒溫法（MycoBlue Mycoplasma Detector）

吸取 1 ul 細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入到反應(yīng)體系中，孵育 1 小時(shí)，若細(xì)胞培養(yǎng)物被支原體污染，支原體 DNA 保守系列會(huì)被等溫 DNA 聚合酶特異性擴(kuò)增，使得反應(yīng)液由紫色變成天藍(lán)色。肉眼可觀察。
 

3.熒光染色法（Mycoplasma Stain Assay Kit）

該方法主要是能與 DNA 特異性結(jié)合的熒光染料 Hoechst33342 或 Hoechst33258，可使支原體內(nèi) DNA 著色，染色后可用熒光顯微鏡觀察。

 

4.酶活法（TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit）

支原體溶解時(shí)釋放出來的酶與 TransDetect Luciferase Mycoplasma Detection Kit 中提供的底物發(fā)生催化反應(yīng)，將 ADP 轉(zhuǎn)化成 ATP，而 ATP 含量的上升，能通過生物發(fā)光化學(xué)反應(yīng)檢測(cè)，并通過分光光度計(jì)進(jìn)行讀數(shù)，從而達(dá)到檢測(cè)支原體的目的。
 

5. PCR 法（Genloci-Mycoplasma Detection Kit）

利用對(duì)支原體基因組中保守的編碼域序列進(jìn)行 PCR 檢測(cè)的方法來進(jìn)行支原體檢測(cè)的。

美德華生的 Mycoplasma Detection Kit （支原體檢測(cè)試劑盒）能夠快速、準(zhǔn)確地檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)中的支原體污染。試劑盒中的 Primers 是依據(jù)支原體基因組中高度保守法人 16SrRNA 編碼域而設(shè)計(jì)的，只需簡(jiǎn)單的 PCR 反應(yīng)就可檢測(cè) M.Arginini, M.Fermentans, M.Hyorhinis, M.Orale, M.Salivarium, M. Hominis, M.Pneumonia 等常見的支原體。多年市場(chǎng)驗(yàn)證準(zhǔn)確度和靈敏度。

 

除此之外還有相差顯微鏡法和電鏡掃描法，不過，因其限制因素較大，在此不進(jìn)行說明。
上述內(nèi)容簡(jiǎn)單介紹了各種檢測(cè)方法的原理，下面總結(jié)一下優(yōu)缺點(diǎn)：

最后，單獨(dú)使用目前市場(chǎng)上任何一種支原體檢測(cè)試劑盒，都無法做到 100% 準(zhǔn)確。嚴(yán)格的支原體檢測(cè)，應(yīng)至少使用二種及以上檢驗(yàn)方法來確定檢驗(yàn)準(zhǔn)確性。